分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-06-27 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 利用甘油醛三磷酸脱氢酶（glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAP）启动子在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2（human goose-type lysozyme 2，hLysG2），并在小试规模建立一套有效的重组hLysG2（recombinant hLysG2，rhLysG2）生产工艺流程。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2基因，将其连接至pGAPZA 质粒中，构建重组表达质粒pGAPZA-hLysG2。将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，通过Zeocin抗性筛选获取高拷贝重组菌株，并在5L生物反应器中进行发酵培养。发酵60 h后发酵液上清酶活性达到最高， 发酵液上清经SDS-PAGE及Western blot检测证实rhLysG2得到表达。与诱导型表达相比，组成型表达发酵时间缩短了48 h，上清中rhLysG2总活性提高了23.8%；使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2进行纯化后，每升发酵液上清可纯化到187.4 mg重组蛋白，纯化产物纯度达99.0%以上；浊度测定法分析显示，在pH 5.6、30℃和0.1 mol/L Na+的条件下，rhLysG2可达到最大酶活性13500 U/mg。利用GAP启动子在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rhLysG2，避免了甲醇的使用，缩短了发酵时间，提高了蛋白产量，为将rhLysG2开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2018-01-12 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 对人源类溶菌酶蛋白6（human lysozyme-like protein 6，LYZL6）在受精过程中的作用进行研究，并对重组LYZL6蛋白（recombinant LYZL6，rLYZL6）的生理特性进行分析，从而揭示其生理功能。细胞免疫荧光法确定LYZL6定位于成熟精子头部的顶体后区域，反转录PCR（RT-PCR）分析表明精子表面的LYZL6蛋白来源于睾丸和附睾的分泌，Western blot法分析表明精子获能前后表面LYZL6的量无明显改变。半透明带结合实验和精子穿透实验分析表明兔抗LYZL6血清未明显抑制人精子结合透明带，但可明显抑制精卵融合。利用毕赤酵母表达系统成功表达了rLYZL6，使用甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析可从发酵上清中纯化到具有生物活性的rLYZL6。酶联免疫吸附法（ELISA）分析显示rLYZL6不具有透明质酸结合能力、透明质酸水解能力和自由基清除活性，但具有较强的肽聚糖结合能力和异肽酶活性。LYZL6由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体后区域，可以参与精卵融合，并具有肽聚糖结合能力和异肽酶活性，提示LYZL6可能通过多种机制参与精子功能。
分类： 生物学 >> 生物工程 提交时间： 2017-12-22 合作期刊: 《中国生物工程杂志》
摘要： 对人源类溶菌酶蛋白6（human lysozyme-like protein 6，LYZL6）在受精过程中的作用进行研究，并对重组LYZL6蛋白（recombinant LYZL6，rLYZL6）的生理特性进行分析，从而揭示其生理功能。细胞免疫荧光法确定LYZL6定位于成熟精子头部的顶体后区域，反转录PCR（RT-PCR）分析表明精子表面的LYZL6蛋白来源于睾丸和附睾的分泌，Western blot法分析表明精子获能前后表面LYZL6的量无明显改变。半透明带结合实验和精子穿透实验分析表明兔抗LYZL6血清未明显抑制人精子结合透明带，但可明显抑制精卵融合。利用毕赤酵母表达系统成功表达了rLYZL6，使用甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析可从发酵上清中纯化到具有生物活性的rLYZL6。酶联免疫吸附法（ELISA）分析显示rLYZL6不具有透明质酸结合能力、透明质酸水解能力和自由基清除活性，但具有较强的肽聚糖结合能力和异肽酶活性。LYZL6由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体后区域，可以参与精卵融合，并具有肽聚糖结合能力和异肽酶活性，提示LYZL6可能通过多种机制参与精子
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